sábado, 5 de junio de 2010

TÉCNICAS DE DETERMINACIÓN EMPLEADAS PARA LA DETECCIÓN DE NANDROLONA Y OTROS ESTEROIDES ANABOLIZANTES EN ORINA:

La detección de esteroides anabolizantes en orina se realiza habitualmente por uno de los siguientes métodos:

a) Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)


b) Cromatografía de gases + Espectrometría de masas (GC/MS)


Explicaremos a continuación las bases de cada uno de ellos:


HPLC:


Uno de los procedimientos empleados en la determinación del analito en la muestra es la cromatografía líquida de alta resolución o HPLC.


Éste es un tipo de cromatografía en columna, en el que la fase móvil, en lugar de descender por acción de la gravedad, es empujada por altas presiones de hasta 400 atm, lo que hace que el proceso se desarrolle mucho más rápido. Esto también permite utilizar un tamaño de partícula mucho menor en el empaquetamiento de la fase estacionaria, lo que aumenta las interacciones entre ésta y la muestra, y permite una mejor separación de los componentes. Además los métodos de detección asociados a esta cromatografía están ya automatizados.

El instrumental consiste en una columna cromatográfica llena de partículas de silica, que constituyen la fase estacionaria. La fase móvil suele ser agua con metanol o acetonitrilo, pudiendo llevar también sales o una disolución tampón.

El tipo más común de HPLC, y el empleado en este caso, es la extracción de fase inversa. En esta columna la silica se encuentra modificada por la adición de cadenas hidrocarbonadas de 8 a 18 átomos de C, por lo que la fase estacionaria tiene carácter apolar, mientras que el solvente tiene carácter polar, lo que implica que los componentes apolares de la muestra (como es nuestro caso, ya que la nandrolona es de naturaleza esteroidea, y por tanto apolar) se eluirán más lentamente, pues quedarán retenidos en la fase estacionaria.

El procedimiento de inyección de la muestra está automatizado.
El tiempo que tarda cada uno de los componentes en ser eluído es el denominado tiempo de retención, y es característico de cada compuesto. Al eluírse cada analito aparece registrado el pico cromatográfico correspondiente en el cromatograma.



Ejemplo: Picos cromatográficos para la nandrolona (NA) y la androsterona (AND), de un estudio realizado sobre este tema: Determination of the origin of urinary norandrosterone traces by gas chromatography combustion isotope ratio mass spectrometry


La detección de los distintos componentes de la muestra a su paso por la columna se realiza mediante la medida de la absorbancia de luz UV. La detección suele realizarse a 200 nm.





En el vídeo que exponemos a continuación se explica perfectamente cómo se lleva a cabo el proceso y cómo ocurre la separación. Es un poco largo pero muy ilustrativo.















GC/MS


La primera parte de la determinación, la cromatografía de gases, ya ha sido explicada en la tarea anterior. Los pasos de estas dos técnicas combinadas se exponen de forma muy sencilla en el siguiente vídeo:







En cuanto a la segunda fase, la espectrometría de masas ( MS por sus siglas en inglés) es una técnica analítica basada en la separación de partículas moleculares o atómicas por su diferente masa y que, por tanto, nos va a permitir determinar la masa molecular de una molécula.


Es aplicable para el análisis de muchos tipos de muestras, desde elementales hasta grandes polímeros y proteínas.


Además, con frecuencia es posible obtener información acerca de los fragmentos producidos cuando se rompen las moléculas.


Están disponibles más de 20 tipos diferentes de espectrómetros de masas que varían en función de la aplicación prevista, pero todos van a presentar 3 partes básicas:



  • Fuente de ionización, en la que se ionizan las moléculas
  • Analizador de masas, en el que se separan los iones por su relación de masa a carga (m/z)
  • Detector, en el que se registran los iones separados.


Así, el proceso de la espectrometría de masas comprende básicamente cuatro etapas:



  • Ionización de la muestra.
  • Aceleración de los iones por un campo eléctrico.
  • Dispersión de los iones según su masa/carga.
  • Detección de los iones y producción de la correspondiente señal eléctrica.



Fig.1: Esquematización del paso de una muestra por los principales componentes de un instrumento de espectroscopia de masas.


- Ionización de la muestra


La ionización de la muestra se consigue por bombardeo mediante un flujo de electrones de alta energía.
Cuando un electrón de alta energía golpea una molécula orgánica, desprende un electrón de valencia de la molécula produciendo un radical catión con carga positiva y un número impar de electrones.


El bombardeo electrónico transfiere tanta energía que la mayor parte de los radicales catión se fragmentan al salir despedidos .


- Aceleración de los iones por un campo eléctrico

En el sistema acelerador, las partículas ionizadas producidas por el impacto de los electrones son obligados a atravesar 3 ranuras: una primera ranura aceleradora por una pequeña diferencia de potencial, una segunda ranura en cuyo espacio entre la primera existe una diferencia de potencial muy alta con la que las partículas alcanzan su velocidad final y una tercera ranura actúa como colimador del haz de partículas.

La velocidad que adquieren viene dada por la fórmula:
v = [2eV/m] ½

Donde V es el potencial aplicado, “e” la carga del electrón y “m” la masa.

Cuando las partículas aceleradas se someten a la acción de un campo magnético (H) describen una trayectoria circular de radio r alrededor de este campo, desarrollando una fuerza centrífuga mv2/r, la cual es igual a la fuerza de atracción del campo.De esto deducimos que el radio es igual a:
r = (2Vm/H2e) ½

- Dispersión de los iones según su relación masa/carga

Basándonos en la ecuación anterior podemos calcular la relación m/e que es:
m/e = H2.r2/2V

Dado que la mayoría de los iones formados en la segunda etapa tienen una sola carga y que el resto de parámetros se mantienen constantes, la relación m/e suele ser la masa del ión

La utilidad analítica de un espectrómetro de masas depende de la resolución del instrumento, o capacidad del mismo para separar dos partículas de diferente masa.

- Detección de los iones y producción de la correspondiente señal eléctrica

El ordenador al que está conectado el aparato recoge las distintas señales y las reproduce en forma de espectrograma.

Existen distintos tipos de espectrometrías de masas, pero todas siguen aproximadamente estas bases teóricas.

En este vídeo podéis ver el proceso:



Hablaremos ahora de determinados parámetros que nos ayudan a la hora de determinar si el sistema analítico empleado es o no fiable o adecuado para esa determinación en concreto.

Límite de detección

El límite de detección es un número expresado en unidades de concentración, que nos define la concentración más baja del elemento que un analista puede decir que es estadísticamente diferente de un blanco analito.

La definición adoptada por la IUPAC en 1975 enuncia que “el límite de detección, expresado como una concentración CL, se deriva de la medida más pequeña YL, que puede ser detectada con una certeza razonable, para un procedimiento analítico dado”

Este concepto fue aclarado posteriormente por la ACS que dice que el límite de detección es la concentración más baja de un analito que un procedimiento analítico puede detectar con seguridad. En la definición del límite de detección, la IUPAC establece ese nivel de seguridad según la siguiente expresión.

YL=YB + K . SB

donde YB es el valor medio de la señal del blanco y SB es la desviación estándar del mismo, K es un factor numérico escogido según el nivel de confianza deseado. El uso de un valor de K igual a 3 recomendado por la IUPAC, nos da un nivel de confianza del 99.86% si el error debido a la señal del blanco sigue una distribución normal.

El límite de detección CL, por tanto, es la concentración de analito que da una señal que es tres veces la desviación estándar del blanco. Se puede expresar así, sustituido ya YL por su valor:

CL= 3 . SB / m

donde m es la pendiente de la curva de calibrado.


Límite de cuantificación

Por otra parte se define el límite de cuantificación, CQ, como la concentración de analito que da una señal que es diez veces la desviación estándar del blanco.

CQ = 10 . SB /m


Sensibilidad

Expresa la respuesta del instrumento analítico para una concentración determinada de analito.

Cuanto mayor sea la variación de la señal analítica “y” para una variación de la concentración del analito “x” dada, querrá decir que el método analítico empleado será más sensible.

La sensibilidad (S) de un método viene dada por la pendiente de la curva de calibrado.

y = mx + b


Calibración

La calibración es el conjunto de operaciones que se establecen para obtener la relación entre las señales producidas por un instrumento analítico y los correspondientes valores de concentración o masas del conjunto de patrones de calibrado.

Curva de calibrado

Es el método de estandarización más utilizado.

Para obtener la curva de calibrado se preparan primero varias disoluciones con cantidades perfectamente conocidas de analito (como mínimo 6 ó 7, para minimizar la posibilidad de error) que se denominan disoluciones patrón. Se incluye también el blanco, que es la disolución que lleva la matriz y todos los componentes de la muestra, excepto el analito en cuestión. Se analizan todas estas disoluciones con el método analítico a calibrar y se representa la señal obtenida para cada concentración.

La relación entre la concentración de analito y la respuesta del instrumento analítico es normalmente lineal.



Las concentraciones de las disoluciones patrón se relacionan con las señales analíticas obtenidas para cada una de ellas.

Ante una muestra de concentración desconocida, se realiza la medida de la señal obtenida y ésta se interpola en la función (recta de calibrado) para obtener el resultado (concentración del analito en la muestra).


La técnica de regresión por mínimos cuadrados proporciona la ecuación de la recta de calibrado.

y = mx + b


El coeficiente de correlación (r) que puede ayudar a medir el grado de ajuste de la recta de calibrado obtenida. El valor de r puede oscilar entre –1 y +1:




Valor próximo a +1 indica una correlación + elevada.
Valor próximo a -1 indica una correlación - elevada.
Si r es próximo a 0, no existe correlación.


Dado que los resultados obtenidos dependen no sólo de la técnica sino también del aparato analítico utilizado, no podemos dar unos datos universales. Como ejemplo expondremos los resultados para la determinación de 19-nandrosterona y otros anabolizantes en orina humana mediante cromatografía de gases – espectrometría de masas derivados de los experimentos descritos en el artículo “Determination of nandrolone and metabolites in urine samples from sedentary persons and sportsmen”(A.M. Galán Martín, J.I. Maynar Mariño, M.P. García de Tiedra, J.J. Rivero Marabé, M.J. Caballero Loscos, M. Maynar Mariño; Journal of Chromatography, B).


La determinación en este caso fue realizada con el sistema GC-MSD formado por un detector selectivo de masa Modelo 5972 combinado con un cromatógrafo de gases modelo 5890 serie II Hewlett- Pakcard). El resto de elementos utilizados podéis consultarlos en el artículo (http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TG9-43S689C-C&_user=2345338&_coverDate=09%2F25%2F2001&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1359835922&_rerunOrigin=google&_acct=C000057006&_version=1&_urlVersion=0&_userid=2345338&md5=5a829bd32270efffebb887a8c5cbfcbe)

  • Límites de detección y de cuantificación:

  • Curva de calibrado:


Quantification of 19-norandrosterone. Calibration curve with on the y-axis the ratio between m/z 405 of 19-NA and m/z 466 of the internal standard 4-chlorotestosterone, and on the x-axis the 19-NA concentration in ng/ ml.
  • Sensibilidad:

Puesto que, como ya hemos dicho, la sensibilidad viene dada por la pendiente de la recta de calibrado, la sensibilidad para este caso concreto será 0,486 señal/ ng. mL-1


En el caso de la HPLC, la sensibilidad depende del tipo de columna empleado para realizarla, pero en general todas suelen presentar una alta sensibilidad, por ello son empleadas en la detección de compuestos farmacéuticos y drogas que se encuentran en muy pequeñas cantidades en el organismo.

jueves, 20 de mayo de 2010

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN EMPLEADAS EN LA DETERMINACIÓN:

a) Extracción en fase sólida:


La primera técnica de separación empleada en este caso ha sido la extracción en fase sólida (SPE), que suele ser el procedimiento más utilizado para tratar la muestra en análisis de compuestos farmacéuticos en muestras biológicas como sangre u orina.

La explicación del procedimiento de la SPE se encuentra en la entrada anterior, ya que esta técnica es también la utilizada en el proceso de preparación de la muestra y tiene por objetivo la preconcentración del analito . Además de llevar a cabo la preconcentración de la muestra, otro de los objetivos de este procedimiento es la separación de sustancias que puedan interferir en el procedimiento analítico.

Normalmente, para la separación de compuestos apolares, como antibióticos, barbitúricos, cafeína o drogas (como es nuestro caso), es empleada la columna C18, con la que se realiza una extracción en fase inversa, que retiene los componentes hidrofóbicos en la columna debido a que la fase estacionaria es una cadena alquil C18H37, de naturaleza apolar, mientras que la fase móvil tiene una polaridad moderada.

En varios de los artículos que hemos consultado sobre la detección de la nandrolona en orina empleaban concretamente la columna de marca comercial Detectabuse TM , pretratada con metanol y agua, preparada especialmente para la detección de drogas en orina humana.


En el siguiente vídeo podemos apreciar cómo se realiza esta extracción de forma automatizada en laboratorio.




b) Cromatografía de gases:

En varios de los artículos consultados, el proceso de determinación se lleva a cabo mediante la técnica de cromatografía de gases (método de separación) asociada a espectrometría de masas (método de determinación).

En el siguiente enlace, se explica ampliamente el uso de este sistema en el vídeo adjunto:
http://upcommons.upc.edu/video/handle/2099.2/1200

- ¿Qué es la cromatografía de gases?

La cromatografía de gases es una técnica utilizada para la separación de compuestos orgánicos e inorgánicos técnicamente estables y volátiles.

La cromatografía de gases tiene la ventaja de disponer de detectores mucho más universales que la cromatografía líquida (por ejemplo, el de ionización de llama). Además, para numerosas aplicaciones, los métodos son más simples, más rápidos y más sensibles que los correspondientes a la cromatografía líquida de alta resolución. La instrumentación requerida para cromatografía de gases también es mucho más sencilla y económica que la empleada en HPLC.

Sin embargo también presenta alguna desventaja: la influencia de la temperatura sobre la distribución del equilibrio es considerable. Por esta razón, la cromatografía de gases se emplea cuando los componentes de la mezcla problema son volátiles o semivolátiles y térmicamente estables a temperaturas de hasta 350-400ºC.

- Tipos de cromatografía de gases:

La cromatografía gas-líquido ( GLC) lleva a cabo la separación por medio del reparto de los componentes de una mezcla química, entre una fase gaseosa que fluye (móvil) y una fase líquida estacionaria sujeta a un soporte sólido. La cromatografía gas-sólido (GSC) utiliza un absorbente sólido como fase estacionaria.

La utilidad de la cromatografía de gases se ve ampliada por la disponibilidad de detectores versátiles y específicos y por la posibilidad de acoplar el cromatógrafo de gases a un espectrómetro de masas o a un espectrofotómetro de infrarrojo.

- Objetivo de la cromatografía de gases:

Un cromatógrafo de gases consiste en varios módulos básicos ensamblados para:

1. Proporcionar un gasto o flujo constante del gas transportador (fase móvil)
2. Permitir la introducción de vapores de la muestra en la corriente de gas que fluye.
3. Contener la longitud apropiada de la fase estacionaria.
4. Mantener la columna a temperatura apropiada
5. Detectar los componentes de la muestra conforme eluyen de la columna.
6. Proveer una señal legible proporcional en magnitud a la cantidad de cada componente.

- Requerimientos:

Los requerimientos básicos en un equipo de cromatografía de gases son:

1. Gas de arrastre o acarreador
2. Puerto de inyección
3. Una columna
4. Un detector
5. Un registrador o cualquier dispositivo de salida para medir la señal del detector
6. Cromatogramas

A continuación podemos ver un esquema:


- Procedimiento:

En cromatografía de gases, la muestra se inyecta en la fase móvil, la cual es un gas inerte
(generalmente He). En esta fase, los distintos componentes de la muestra pasan a través de la
fase estacionaria que se encuentra fijada en una columna.

La columna se encuentra dentro de un horno con programación de temperatura. La velocidad de migración de cada componente (y en consecuencia su tiempo de retención en la columna) será en función de su distribución entre la fase móvil y la fase estacionaria. Cada soluto presente en la muestra tiene una diferente afinidad hacia la fase estacionaria, lo que permite su separación: los componentes fuertemente retenidos por esta fase se moverán lentamente en la fase móvil, mientras que los débilmente retenidos lo harán rápidamente.

Un factor clave en este equilibrio es la presión de vapor de los compuestos (en general, a mayor presión de vapor, menor tiempo de retención en la columna). Como consecuencia de esta diferencia de movilidad, los diversos componentes de la muestra se separan en bandas que pueden analizarse tanto cualitativa como cuantitativamente mediante el empleo de los detectores seleccionados.

En el siguiente vídeo, aunque está en inglés, se puede comprender mejor el proceso:

La asociación de la cromatografía de gases (GC) y la espectrometría de masas (MS) da lugar a una técnica combinada GC-MS que permite la separación e identificación de mezclas complejas.

domingo, 9 de mayo de 2010

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ORINA PARA LA DETERMINACIÓN

Antes de centrarnos en la preparación de la muestra en sí, explicaremos el proceso de recogida de la muestra y conservación hasta su análisis en el laboratorio así como las consideraciones legales del proceso de recogida de muestras que deben tenerse en cuenta en los controles anti-doping.


Recogida de muestra de orina para estudio analítico.


- Objetivo:Obtener volumen suficiente de orina en condiciones adecuadas para la determinación analítica.

El procedimiento utilizado normalmente para la toma de muestras de orina en pacientes adultos, colaboradores y que controlan sus esfínteres es el siguiente: RECOGIDA DE ORINA POR MICCIÓN ESPONTÁNEA.
Es una técnica fácil, barata, no invasiva y de rápida ejecución. Tiene una alta fiabilidad cuando se realiza en condiciones higiénicas estrictas, por eso debemos asegurarnos de usar guantes y realizar un buen lavado del área genital.

Algunas consideraciones adicionales:
- La primera orina de la mañana es especialmente útil, ya que suele ser la mas concentrada, por lo tanto, es mas probable que revele anormalidades y la presencia de sustancias, también es relativamente libre de influencias de la dieta y de los cambios que se producen por la actividad física, ya que se recolecta después de un periodo de ayuno y reposo.
- El recipiente de la muestra deberá ir debidamente identificado y acompañado de la petición rellenada por el facultativo.
- La materia fecal y la sangre menstrual contaminan la orina. Las muestras deben estar libres de contaminación fecal o de papel higiénico
- Si la muestra no se refrigera dentro de la primera hora después de la recolección, se pueden producir cambios en la composición y en el pH de la orina por acción de las bacterias.
- También hay que tener en cuenta que muchos fármacos alteran el color de la orina.

Recipientes para la recolección y conservación de la muestra:
- Los recipientes deben estar muy limpios y deben cumplir con las siguientes condiciones:
- Ser de plástico irrompible, de boca ancha, seco, limpio o estéril y translúcido. La excepción es la determinación de sustancias fotosensibles, que exigiría el uso de contenedores opacos.
- Deben ser desechables y no volverse a utilizar.
- La tapa debe cerrar herméticamente de tal manera que el contenido no se derrame, independientemente de la posición del recipiente.
- Deben tener una capacidad de 50 cc.
- El diseño del recipiente debe permitir que la etiqueta no se despegue aún en condiciones de refrigeración o de congelación. Es importante pegar la etiqueta en el recipiente no en la tapa para evitar equivocaciones de tapas.
- El recipiente de la muestra deberá ser colocado en una bolsa de plástico, sellada y etiquetada de forma visible con un rótulo.


En el caso de los controles antidopaje, también deben tenerse en cuenta el procedimiento legal a seguir en el momento de recogida de la muestra, que es el siguiente:

- Elección de un frasco de recogida de orina.
El deportista será requerido a elegir un frasco de plástico para la recogida de la orina.


- Suministro de la muestra de orina bajo supervisión
El responsable encargado podrá observar al deportista suministra la muestra de orina. Deberá proveer al menos 80 ml. de orina.


- Elección de los envases de seguridad
Una vez que el deportista ha suministrado la cantidad suficiente, para lo cual dispone del tiempo que sea necesario, será requerido a elegir una pareja de envases de seguridad.




- División de la muestra y medición del pH y la densidad
A continuación se solicitará al atleta que divida su muestra entre el frasco “A”
(40 ml. Como mínimo) y el frasco “B” (30 ml. Como mínimo). El médico encargado medirá el pH y la densidad urinarias en un pequeño residuo de orina que el deportista habrá dejado en el frasco de plástico de recolección.
Aparte de anomalías en el color, se exige volumen mínimo (50-70 ml) y se considera normal un pH igual o inferior a 6,5 y una densidad igual o superior a 1,105.


- Precintado de las muestras
Una vez que el atleta y el médico encargado se han asegurado de que los frascos “A” y “B” están correctamente cerrados y adecuadamente identificados, se precede a su poner los frascos sellados en la caja de que corresponda, la cual será cerrada.


- Cumplimentación del formulario de Control Anti-dopaje.
El médico encargado del control, anotará los códigos de los frascos “A” y “B” y los de los precintos.


- Firma del formulario de Control Anti-dopaje


- Transporte de las Muestras al Laboratorio
Las muestras de orina son transportadas por los médicos encargados, o por una empresa de transporte que ofrezca suficientes garantías de seguridad, hasta el Laboratorio acreditado que las analizará.
El Laboratorio recibe una copia del formulario de Control Anti-dopaje que detalla solo la información relativa a la muestra de orina (códigos de frasco, precintos, etc.) La mencionada copia no contiene ninguna otra información que pueda permitir que el atleta sea identificado.


Este procedimiento se encuentra más detalladamente en este enlace:
http://www.lexureditorial.com/boe/0905/07628-23.htm



Conservación de la muestra:

Una vez obtenida la orina debe remitirse rápidamente al laboratorio ya que es conveniente procesar la muestra fresca, antes de que pasen dos horas desde su recolección. Si esto no es posible puede refrigerarse a 4º C hasta un máximo de 24 horas. También pueden añadirse sustancias conservantes y estabilizadoras.
Cuanto más pronto se procese la muestra, más fiables son los resultados. En casos particulares se puede procesar la orina pasados este tiempo, pero debe aclararse esta situación en el informe
El laboratorio debe controlar el transporte, garantizándose el que las muestras han sido refrigeradas desde el momento de su toma, o en su caso la utilización de algún conservante
Cuando la muestra se tenga que estabilizar por la presencia de un componente inestable o porque el análisis vaya a demorar, se deberán añadir preservadores o estabilizadores al recipiente o a la muestra de orina directamente. Estas sustancias disminuyen la oxidación y el crecimiento bacteriano y evitan cambios en el pH. Los más utilizados son el ácido bórico, benzoico, los fenoles, timol, tolueno, formol. Por ejemplo, ácido bórico al 2% o el sistema comercial con bórico-formiato; o tubos con un medio conservador (B-D, Becton-Dickinson, Cockeyville), que aunque encarece la prueba, permite la conservación de la orina durante más de 24 horas y evita, en muchas ocasiones, resultados falsos positivos.


Además, en el momento de realizar el análisis, hay que tener en cuenta que cuando se, maneja cualquier muestra de orina en el laboratorio hay que llevar guantes y los tubos de centrifugación deben estar tapados o sellados para evitar la transformación de aerosoles. La muestra de pacientes de orina con SIDA, hepatitis y otras enfermedades contagiosas requerirán consideración especial.



PREPARACIÓN DE LA MUESTRA EN SÍ:


El proceso de preparación de las muestras de orina para la posterior determinación puede dividirse, en general, en los siguientes pasos:


1. Extracción en fase sólida (preconcentración)
2. Hidrólisis enzimática
3. Extracción líquido – líquido
4. Derivatización


A continuación, explicaremos más pormenorizadamente estos pasos e indicaremos las variaciones que puede haber en cada uno de ellos.


EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA (SPE): PRECONCENTRACIÓN

El primer paso para la preparación de la muestra de orina, es añadir 17-α-metiltestosterona como patrón interno (explicación del uso de patrones internos en el comentario de esta entrada) y una solución tampón, que puede ser o bien tampón acetato (pH 5,2, 0,2M) o bien tampón fosfato (pH 7, 0,2M).
Tras este paso, lo normal es realizar una estracción en fase sólida (SPE) en una columna C18 para preconcentrar la muestra, aunque en algún caso puede omitirse este paso.


Una columna SPE consiste en un lecho de adsorbente de partículas gruesas mantenido entre dos discos porosos en un tubo desechable y la técnica se basa en la aplicación de la solución que contiene el analito sobre una fase sólida (fase estacionaria) que lo adsorbe específicamente. Esta fase estacionaria, suele estar compactada en el fondo de una pequeña columna de plástico y después de la adsorción los analitos se eluyen con una pequeña cantidad de otro disolvente con el que interaccionan más fuertemente que con la fase estacionaria, por lo que no sólo se consigue un cambio de matriz del analito, sino que se reduce el volumen de la muestra aumentando su concentración.


Se lleva a cabo en 5 etapas:

1. Activación. El primer paso es la activación (A) en la que se utiliza un solvente orgánico para "humidificar" la fase.


2. Acondicionamiento. La fase estacionaria SPE se acondiciona con el mismo solvente de la matriz, por ejemplo, en este caso 5Ml mETANOL + 5 Ml AGUA DESIONIZADA El acondicionamiento permite "alinear" la fase estacionaria lejos de la superficie de la sílice, permitiendo la interacción entre el analito y la fase estacionaria. Cualquier solvente orgánico residual se elimina en esta etapa, asegurando que los componentes de interés sean retenidos en la parte superior de la columna.


3. Retención. Las interacciones entre las moléculas de la muestra y la fase estacionaria controlan la retención en el adsorbente de SPE. Para maximizar las interacciones la muestra (A=analitos + M=matriz) deben cargarse en el adsorbente de SPE a aproximadamente 3 ml/min. Los componentes de interés han de retenerse en el adsorbente de SPE mientras que la matriz y los contaminantes deben eluirse y descartarse.
Durante la etapas 1-3 el adsorbente SPE ha de mantenerse húmedo siempre, puesto que el secado del mismo puede acarrear una pérdida de muestra.


4. Eliminar interferencias. Usando un solvente o una serie de solventes de fuerza creciente los contaminantes pueden eliminarse del adsorbente de SPE hasta que solo los analitos de interés quedenatrapados. Lavada sucesivamente con 5 mL de agua desionizada


5. Elución. 5mL de metanol



En esta página web se puede encontrar una explicación muy ilustrativa de este proceso: http://www.sigmaaldrich.com/Graphics/Supelco/objects/4600/4538.pdf (página 6)



Por último, se lleva a cabo un proceso de secado mediante evaporación del metanol con una corriente de nitrógeno a 50ºC; este paso se puede realizar mediante un sistema automatizado, como la TurboVap LV Evaporator (Zymark).


HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LOS GLUCUROCONJUGADOS:

A continuación, el residuo sólido se diluye en una solución tampón, normalmente la misma que hayamos utilizado en el primer paso y se le añade una pequeña cantidad de solución con la enzima β-glucuronidasa extraída de E. coli o Helix pomatia. La hidrólisis durará más o menos en función de la temperatura y cantidad de enzima añadida (a mayor temperatura y concentración, menor tiempo).


Después de enfriarla a temperatura ambiente, la muestra puede ser centrifugada a 2000 – 3000 g para eliminar residuos sólidos o pasar directamente al siguiente paso.


EXTRACCIÓN LÍQUIDO – LÍQUIDO:


Para la extracción líquido – líquido, primero se ajusta el pH mediante un tampón carbonato/bicarbonato de sodio (pH 8,5) o carbonato potásico (pH 9).
A continuación, la mezcla se extrae con dietil éter, n-pentano, tertbutimetiléter, mezcla de n-hexano/ dietiléter (8:2 (v/v))… Esta extracción se puede realizar con un agitador o un mezclador de laboratorio.
La fase orgánica puede centrifugarse después o no y el solvente se evapora hasta el secado con una ligera corriente de nitrógeno.

En algún artículo, se indica que en lugar de esta extracción se vuelve a repetir el proceso de extracción en fase sólida con la columna C18 ya usada de NH2 y reacondicionada con etilacetato; se eluye el analito con etilacetato, se evapora y se disuelve una vez más en metanol para ser inyectada al sistema de HPLC.

También se puede un añadir agente desproteinizante como el TCA (solución de ácido tricloroacético) a la muestra y centrifugarlo para eliminar el precipitado. Al sobrenadante obtenido se le añadiría K2HPO4 y IL, se centrifugaría para separar la fase orgánica y esta se inyectaría en el sistema de HPLC para determinar, por ejemplo el nivel de testosterona – epitestosterona.


DERIVATIZACIÓN:


Antes de llevar a cabo la derivatización, se introduce la muestra en una desecadora durante aproximadamente 1 hora.


Este proceso se lleva a cabo para transformar los compuestos no volátiles en compuestos volátiles para la posterior determinación (cuando en el proceso se lleva a cabo cromatografía de gases). Así, el objetivo de la derivatización es obtener los bis-trimetilsilil (TMS éteres) derivados de la 19 – norandrosterona y 19 – noretilcolanolona, metabolitos principales de la nandrolona.
Un compuesto muy utilizado en esta técnica es el N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida (MSTFA) solo o combinado con otros compuestos (por ejemplo la combinación MSTFA:NH4I:mercaptoetanol (1000:2:6 v/p/v) o MSTFA–TMIS–DTE (1000:5:5, v/v/w)). Tras la adición de esta mezcla, se procede a la incubación a 70-80ºC durante aprox. 30 minutos, aunque el tiempo depende del reactivo.

Metabolitos derivados de la nandrolona ya derivatizados

jueves, 22 de abril de 2010

EXACTITUD Y PRECISIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO


DETERMINACIÓN DE LA EXACTITUD DE UN MÉTODO ANALÍTICO:


La exactitud se refiere a la desviación de un resultado analítico respecto al valor verdadero, por tanto, se relaciona con la existencia de un error sistemático que haga que los resultados se desvíen de forma constante respecto a los valores esperados; es decir, que la media experimental difiera del valor verdadero.


Existe material de referencia para la determinación de nandrolona en la muestra, que se usan en los protocolos propuestos por la agencia mundial antidoping (WADA), para la verificación de la calidad de la metodología analítica utilizada. Nosotros encontramos el material siguiente, que es nombrado en varios artículos referidos a análisis de nandrolona en orina:


19-Norandrosterone (2.13 ng/g) en orina humana liofilizada (freeze-dried) (20 mL)
nº de referencia MX002


Además de este ejemplo, existe material de referencia para todos los demás esteroides anabolizantes prohibidos en competición cuya producción es financiada por el WADA (World Anti-Doping Agency) y el COI (Comité Olímpico Internacional). Podemos consultar algunos de ellos en la siguiente lista:

Además, como curiosidad, cabe mencionar que sólo la WADA tiene la capacidad de acreditar el material de referencia certificado referido a estas sustancias y que controla el acceso a los mismos a través de acreditaciones: sólo los laboratorios reconocidos por este organismo tienen acceso a dicho material.

El análisis de este material de referencia certificado, nos permitirá determinar si nuestro método analítico es exacto o no comparando el valor verdadero (la concentración certificada) con la media experimental que hayamos obtenido aplicando el test estadístico t de student.

En cuanto a los métodos oficiales, el WADA publica criterios de validación de los métodos analíticos, que usan los laboratorios para valorar la calidad de su metodología. Se suele usar el documento técnico TD2003IDCR, que podemos consultar en el siguiente link: http://www.wada-ama.org/rtecontent/document/criteria_1_2.pdf


DETERMINACIÓN DE LA PRECISIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO:


Una vez vistos los métodos de análisis que podemos emplear en la determinación de anabolizantes en orina, realizaremos un estudio para comprobar la precisión de éstos (y si hay varios métodos determinar cuál de ellos es más preciso).

La precisión es el nivel de concordancia entre los resultados obtenidos cuando aplicamos varias veces el mismo método analítico a la misma muestra. Cuánto menor es el grado de concordancia, menor es la precisión, y esto es indicativo de que el método presenta errores aleatorios, que hacen que el resultado se desvíe del valor medio. Por el contrario, cuanto mayor sea el grado de concordancia entre los resultados, mayor precisión presentará el método analítico, lo que indica que el método no presenta errores aleatorios, o que estos errores son aceptables.

Para determinar la precisión debemos conocer la varianza de los resultados. Con ella podremos calcular el coeficiente de variación. Por norma general, si éste es menor del 5% el método se puede considerar preciso.

El coeficiente de variación se calcula mediante la siguiente expresión matemática:La varianza también permite comparar dos métodos analíticos, siendo más preciso el que presente menor varianza.
Además, para comprobar si existe una diferencia real entre las varianzas de los dos métodos, es decir, para determinar si son igual de precisos o no, podemos aplicar el test F de dos colas utilizando los resultados obtenidos para la desviación típica o estándar. Esto nos permite, por ejemplo, determinar si un método es preciso o no testándolo con otro del que sabemos que sí lo es.
La medida de la desviación estándar puede ser subdividida en 3 categorías:

- Repetibilidad: Da una idea del tipo de variabilidad que se puede esperar cuando el método es desarrollado por un mismo analista, en un mismo laboratorio con un mismo instrumento analítico y en un periodo corto de tiempo. Por ejemplo, la variabilidad esperada entre los resultados cuando la muestra es analizada por duplicado.


- Reproducibilidad: Se obtienen resultados independientes mediante el mismo método aplicado a la muestra en diferentes condiciones (diferentes laboratorios, diferentes instrumentos analíticos, diferente analista, periodos largos de tiempo…).


- Precisión intermedia: ha sido definida por la ICH como la variabilidad obtenida en un análisis realizado en un mismo laboratorio en un periodo de tiempo prolongado.
La repetibilidad y la reproducibilidad dependen de la concentración de analito y, en consecuencia, debieran determinarse para varias concentraciones. Lo más común es hacer 11 réplicas del analito en una disolución patrón, aunque este número de réplicas se puede variar en función de diversos factores.

Por ejemplo, en el texto: "The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A laboratory guide to method validation and related topics. Eurachem Guide, 1998 y Guía para la validación de métodos de ensayo. OAA.DC-LE-05", encontramos esta tabla que muestra el número de réplicas que consideran que se deberían elaborar relacionadas con repetibilidad y reproducibilidad.




El criterio de aceptación utilizado depende del tipo de análisis que se esté realizando. Por ejemplo, en análisis farmacológicos, se suele considerar preciso un método si su CV es menor del 1%; sin embargo, lo más común en muestras biológicas como es el caso de la orina, se suele aceptar una CV menor al 15% a concentración límite o al 10% a otras concentraciones.
Aunque como ya hemos dicho, por norma general se acepta que un método es preciso cuando su CV es menor al 5%.

Como ejemplo del cálculo de la precisión de un método analítico, vamos a considerar el caso real de la determinación de 19-norandrosterona en orina humana por Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas de Trampa de Iones realizada por Juan Francisco Sánchez Bruzón, Rodny Montes de Oca Porto, Mirta Torres Castellanos, Roberto
Oropesa Rodríguez y Mario José Granda Fraga para el Instituto de Medicina del Deporte, Laboratorio Antidoping, de la Ciudad de La Habana. El artículo completo puede leerse en este link http://www.cnic.edu.cu/revista%20CENIC/revista/files/CQ-2004-2-059-068.pdf :

Precisión intra-ensayo (repetibilidad)
En este caso, la precisión se estudió a dos niveles de concentración (una más baja de 0,5 ng/mL y una de mayor concentración de 10 ng/mL). Se procesaron cuatro réplicas de cada nivel de concentración en un mismo día y se calculó el coeficiente de variación de los tiempos de retención relativos (TRR) y el CV de la relación entre los iones.
Como criterio de aceptación, se tuvo en cuenta que el CV para el nivel inferior fuese menor al 20 % y en el nivel superior menor de un 10 % para ambos parámetros.


Además, se aplicó la prueba de Dixon para descartar errores groseros (r10 de la tabla de Dixon para una probabilidad del 5 %).


Los resultados que obtuvieron se reflejan en las dos tablas inferiores: se observa que el método cumple con los límites de aceptación establecidos previamente.





lunes, 22 de marzo de 2010

DETEMINACIÓN DE ESTEROIDES ANABOLIZANTES EN LA ORINA II: Un arma de doble filo; el doping


Legislación sobre niveles máximos admitidos del analito en esa muestra:



Los esteroides anabolizantes androgénicos (EAA, AAS en inglés), están prohibidos a nivel deportivo tanto dentro como fuera de las competiciones.


Dentro de este grupo, hemos de diferenciar entre EAA endógenos, es decir, que pueden ser producidos por nuestro cuerpo y EAA exógenos que no son producidos por nuestro cuerpo. En cualquiera de los casos, si el análisis demuestra de manera fiable que existen restos de una sustancia prohibida a cualquier concentración de origen exógeno, el deportista será sancionado sin necesidad de análisis complementarios.


Entre los esteroides anabolizantes exógenos, podemos nombrar boldenona, danazol, fluoximesterona, metenolona, nandrolona, estanozolol o trenbolona aunque la lista es mucho más larga.


La nandrolona fue incluida en las listas de sustancias prohibidas en los Juegos Olímpicos de Montreal (1976), mismo año en que se desarrollaron mejores técnicas para la detección de esteroides anabolizantes en orina y la Agencia Mundial Contra el Dopaje (WADA) en su última revisión en 2004 establece los niveles máximos permitidos en la orina en 2 ng/mL (2ppb) para hombres y hasta 5 ng/mL (5ppb) en mujeres debido a que en estas se puede hallar en el líquido folicular y orina entre las semanas 6 y 14 de embarazo o pueden estar consumiendo en ciertos anticonceptivos o preparaciones para retrasar la menstruación que pueden contener noretisterona que da positivo en los controles. De todos modos, análisis con una concentración mayor de 2 ng/mL deben ser reportados a la WADA independientemente del sexo del deportista.
La mayoría de los deportes utilizan estos parámetros a la hora de sancionar, pero por ejemplo la UCI (Unión Ciclista Internacional) establece su propio límite en 4 ng/ml para la nandrolona.


La detección de dopaje con esteroides anabolizantes endógenos es más compleja, puesto que se debe demostrar que los niveles elevados se deben al consumo de sustancias dopantes y no a una síntesis endógena anormal.
Dentro de este grupo podemos destacar los siguientes: androstenediol, androstendiona, dehidroepiandrosterona (DHEA), dihidrotestosterona (DHT), testosterona y sustancias relacionadas.


Cuando no es posible determinar el origen exógeno de esa sustancia, por ejemplo la testosterona, se recurre al análisis de la relación testosterona/epistestosterona: si esta relación es superior a 6:1, se considera una infracción a menos que se demuestre que se debe a una condición natural o a una enfermedad; si es superior a 4:1, se aplican métodos analíticos más fiables, como el espectrómetro de masas de relación isotópica (IRMS) y en caso de que este tampoco aporte pruebas del origen exógeno de la sustancia, se elaborará un estudio longitudinal del deportista analizando controles anteriores y realizando otros 3 controles sin previo aviso en los siguientes 3 meses para poder determinar con firmeza un Resultado Analítico Adverso.


Hemos de tener cuidado con lo que se denomina “orina inestable” y que se ha descubierto recientemente; en algunas muestras, se produce la formación de 19-Noretiocholanolona (19-NE) y 19-Norandrosterona (19-NA) (intermediario utilizado para la determinación de dopaje por nandrolona) tras incubación, lo que puede provocar un falso positivo. Debido a esto, es probable que hayan existido sanciones injustas a lo largo de la historia del deporte ante las que ahora es imposible actuar.


Si queréis saber más acerca de la legislación antidoping en España, podéis consultar este vínculo que contiene la Ley Orgánica 7/2006, de 21 de noviembre, de protección de la salud y de lucha contra el dopaje en el deporte:



Concentración normal o usual del analito en esa muestra:


Nandrolona:

En estudios realizados, se ha determinado que la concentración de 19-norandrosterona suele ser menor de 0,1 ng/ml en hombres y en muestras de mujeres recogidas durante la ovulación han mostrado un máximo de 0,8 ng/ml y están relacionados aparentemente con los altos niveles de estrógenos.


Testosterona:

En individuos sanos, la relación testosterona /epistestosterona es siempre inferior a 2.


Problemática analítica:


Se fueron de 'doping'

El control antidopaje descubre la trampa en la que ha incurrido un deportista con tal de sentir el dulce sabor del triunfo, pero evidencia también la desesperación por hacer más de lo humanamente posible. Aquí algunos casos famosos.


Ben Johnson

Uno de los primeros escándalos mundiales correspondió a los Juegos Olímpicos de Seúl 1988, cuando Ben Johnson, tras batir el récord mundial de los 100 metros lisos con 9,79 segundos, fue hallado culpable de haber utilizado esteroides. Además de conseguir esa marca, el jamaiquino nacionalizado canadiense venció por segunda vez a Carl Lewis, pero la decepción tras del hallazgo envolvió a los aficionados del atletismo cuando Johnson aceptó su culpa. Tras cumplir su sanción, el velocista dio nuevamente positivo en 1993, lo que terminó por completo con su carrera como atleta.


En 2001, se conoció el positivo del holandés del FC Barcelona Frank de Boer por nandrolona. La UEFA le impuso un año de suspensión, luego reducida a dos meses y medio y ese mismo año, el centrocampista español José Guardiola, del Brescia italiano, dio positivo por la misma sustancia.





Para el astro del fútbol Diego Armando Maradona, el mundo del arrepentimiento forma parte de su vida hasta la actualidad. La primera vez que Maradona tuvo contacto con las drogas fue entre 1983 y 1984 cuando se encontraba jugando para el FC Barcelona. Después de esto el 'Pelusa' protagonizó bochornosos incidentes a causa de su adicción a las drogas, como aquella vez en el Mundial de EE.UU. 94, cuando tras el partido con Nigeria dio positivo en un control antidopaje.


En 1998, el español Pedro Delgado ya se vio involucrado en un supuesto caso de dopaje del que no fue sancionado al no encontrarse la sustancia que se detectó en sus análisis de sangre entre los productos prohibidos por la Unión Ciclista Internacional (UCI), si lo estaba por el Comité Olímpico Internacional (COI), pero no por el máximo organismo del ciclismo internacional.A Delgado se le detectó en sus análisis de orina un producto denominado "probenecide" que no estaba prohibido por la UCI pero sí por el COI, lo que no le acarreó ningún tipo de sanción, como tampoco años después al estadounidense Lance Armstrong, siete veces vencedor del Tour de Francia, de quien se sospecha pudo doparse en su primer Tour de Francia pero del que nada se ha podido probar.



David Meca dio positivo en enero de 1999 en el control de dopaje que se le efectuó con ocasión de una competición disputada en Salvador de Bahía (Brasil). Este tipo de análisis se lleva a cabo por medio de la espectrometría de masas, un método que ha ganado en eficacia desde 1995 con la aparición de las técnicas de alta resolución. En concreto, la sustancia que se identifica es la 19-norandrosterona, principal metabolito de la nandrolona. La controversia comienza precisamente con dicho metabolito, que puede aparecer naturalmente en la orina de muchas personas, aunque en niveles bajos. En el caso de Meca, sus abogados argumentaron que el origen de su elevado nivel de nandrolona estaba en un plato típico de la región, el Sarapatell, que el nadador había ingerido con anterioridad a la competición. El propio David Meca explicó con detalle las características del plato brasileño, un guiso a base de carne, hígado, intestinos y riñón de cerdo no castrado. Su caso no es el primero en el que se apunta a la comida como fuente de dopaje.

DETERMINACIÓN DE ESTEROIDES ANABOLIZANTES EN ORINA I: Propiedades


Importancia y motivo de la determinación:

La nandrolona es uno de los esteroides anabolizantes andrógenos sintéticos más utilizados por los atletas que necesitan potencia y fuerza muscular. Deriva de la testosterona, la principal hormona sexual producida en el hombre. Una pequeña modificación química hace a la nandrolona más anabolizante que andrógena y explica su abuso en el deporte. La testosterona tiene un índice anabolizante-andrógeno de 1, mientras que el de la nandrolona es de 10, lo cual demuestra sus poderosas propiedades anabólicas.



La nandrolona se sintetizó por primera vez en 1950. Desde entonces, se produjeron los
noresteroides para un amplio uso terapéutico en afecciones como órganos sexuales de baja actividad, enfermedades sanguíneas o anticoncepción. Los atletas utilizan la nandrolona para acelerar el desarrollo muscular e incrementar la masa corporal. La nandrolona también se utiliza para lograr una recuperación más rápida. Independientemente de la intención, los efectos secundarios de la nandrolona son peligrosos para los atletas. La nandrolona se puede inyectar o administrar por vía oral. También se pueden utilizar los precursores como la 19-norandrostenediona o el 19-norandrostenediol, que actualmente son populares con los suplementos prohormonales nutricionales.




Propiedades del analito



La nandrolona

La nandrolona en un esteroide anabolizante androgénico (influye en las características sexuales masculinas). Se trata de una sustancia artificial producida sintéticamente por la industria farmacéutica, que favorece la síntesis de proteínas y el desarrollo muscular.

En los deportistas la nandrolona incrementa la fuerza, la velocidad, la agresividad y la potencia. Además, favorece la capacidad de recuperación tras el esfuerzo físico.

El abuso de esta sustancia aumenta el riesgo de esterilidad y de enfermedades del hígado, y en mujeres aumenta la masculinización.

La nandrolona se puede inyectar aunque la vía más común es mediante el consumo de preparados dietéticos para deportistas.

La testosterona

La testosterona es una hormona esteroide sintetizada en el cuerpo humano a partir de colesterol. En el hombre adulto regula las proteínas de los músculos, las funciones sexuales, la maduración de los glóbulos rojos, los lípidos plasmáticos, el metabolismo óseo y algunas funciones cerebrales.

Tras su consumo vía oral, la testosterona se absorbe desde el intestino delgado y se degrada rápidamente en el hígado. La mayor parte de convierte en compuestos inactivos. Por lo tanto, los esteroides anabólicos sintéticos se modifican para alterar la potencia anabólica y andrógena y para disminuir el índice de inactivación.




Los derivados alquilados de la testosterona son relativamente resistentes a la degradación hepática. Los que se usan comúnmente son el etanazolol, danazol, fluoximesterona, metiltestosterona, metandrostenolona, oxandrolona y oximetolona.

La esterificación hace más soluble a la hormona. Algunos ejemplos son el decanoato de nandrolona, boldenona, trenbolona, metenolona y enantato de testosterona.





Propiedades de la muestra:


La orina es un producto de excreción líquido, acuoso, de color entre transparente y amarillento (debido al pigmento urozantina), procedente de la filtración de la sangre por los riñones y eliminado al exterior por el aparato urinario.



Propiedades Físicas de la Orina

COLOR Variable, según cantidad de agua ingerida

VOLUMEN 800 a 1800 ml. diarios.

DENSIDAD 1.010 a 1.030

PROTEINAS No contiene

ACIDEZ PH Normalmente suele estar próximo a la neutralidad (6’0- 7’0) pero puede variar entre 4’8 y 8’0.

OSMOLARIDAD 50-1200





Composición Química de la Orina



La orina normal contiene un 96% de agua, siendo el restante porcentaje residuos metabólicos como urea (el principal producto de degradación de las proteínas), sales en disolución y productos orgánicos, por ejemplo nitrógeno, cloruros, cetosteroides, fósforo, amonio, creatinina y ácido úrico.
Composición de la orina en g/l de fluido:







· Urea: 20 g/l
· Ácido úrico: 0.5 g/l
· Cloruro de sodio: 10 g/l
· Sulfatos: 3 g/l
· Fosfatos: 2,3 g/l
· Creatinina: 0,9 g/l
· Sales de amonio: 0,7 g/l

Además la orina contiene en menor cantidad sustancias como calcio, cistina, glucosa, vitaminas, pigmentos…y también gases en disolución, mayoritariamente CO2, pero también N2 y en menor cantidad O2.