La detección de esteroides anabolizantes en orina se realiza habitualmente por uno de los siguientes métodos:
a) Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
b) Cromatografía de gases + Espectrometría de masas (GC/MS)
Explicaremos a continuación las bases de cada uno de ellos:
HPLC:
Uno de los procedimientos empleados en la determinación del analito en la muestra es la cromatografía líquida de alta resolución o HPLC.
Éste es un tipo de cromatografía en columna, en el que la fase móvil, en lugar de descender por acción de la gravedad, es empujada por altas presiones de hasta 400 atm, lo que hace que el proceso se desarrolle mucho más rápido. Esto también permite utilizar un tamaño de partícula mucho menor en el empaquetamiento de la fase estacionaria, lo que aumenta las interacciones entre ésta y la muestra, y permite una mejor separación de los componentes. Además los métodos de detección asociados a esta cromatografía están ya automatizados.
El instrumental consiste en una columna cromatográfica llena de partículas de silica, que constituyen la fase estacionaria. La fase móvil suele ser agua con metanol o acetonitrilo, pudiendo llevar también sales o una disolución tampón.
El tipo más común de HPLC, y el empleado en este caso, es la extracción de fase inversa. En esta columna la silica se encuentra modificada por la adición de cadenas hidrocarbonadas de 8 a 18 átomos de C, por lo que la fase estacionaria tiene carácter apolar, mientras que el solvente tiene carácter polar, lo que implica que los componentes apolares de la muestra (como es nuestro caso, ya que la nandrolona es de naturaleza esteroidea, y por tanto apolar) se eluirán más lentamente, pues quedarán retenidos en la fase estacionaria.
El procedimiento de inyección de la muestra está automatizado.
El tiempo que tarda cada uno de los componentes en ser eluído es el denominado tiempo de retención, y es característico de cada compuesto. Al eluírse cada analito aparece registrado el pico cromatográfico correspondiente en el cromatograma.
Ejemplo: Picos cromatográficos para la nandrolona (NA) y la androsterona (AND), de un estudio realizado sobre este tema: Determination of the origin of urinary norandrosterone traces by gas chromatography combustion isotope ratio mass spectrometry
La detección de los distintos componentes de la muestra a su paso por la columna se realiza mediante la medida de la absorbancia de luz UV. La detección suele realizarse a 200 nm.
En el vídeo que exponemos a continuación se explica perfectamente cómo se lleva a cabo el proceso y cómo ocurre la separación. Es un poco largo pero muy ilustrativo.
GC/MS
La primera parte de la determinación, la cromatografía de gases, ya ha sido explicada en la tarea anterior. Los pasos de estas dos técnicas combinadas se exponen de forma muy sencilla en el siguiente vídeo:
En cuanto a la segunda fase, la espectrometría de masas ( MS por sus siglas en inglés) es una técnica analítica basada en la separación de partículas moleculares o atómicas por su diferente masa y que, por tanto, nos va a permitir determinar la masa molecular de una molécula.
Es aplicable para el análisis de muchos tipos de muestras, desde elementales hasta grandes polímeros y proteínas.
Además, con frecuencia es posible obtener información acerca de los fragmentos producidos cuando se rompen las moléculas.
Están disponibles más de 20 tipos diferentes de espectrómetros de masas que varían en función de la aplicación prevista, pero todos van a presentar 3 partes básicas:
- Fuente de ionización, en la que se ionizan las moléculas
- Analizador de masas, en el que se separan los iones por su relación de masa a carga (m/z)
- Detector, en el que se registran los iones separados.
Así, el proceso de la espectrometría de masas comprende básicamente cuatro etapas:
- Ionización de la muestra.
- Aceleración de los iones por un campo eléctrico.
- Dispersión de los iones según su masa/carga.
- Detección de los iones y producción de la correspondiente señal eléctrica.
Fig.1: Esquematización del paso de una muestra por los principales componentes de un instrumento de espectroscopia de masas.
- Ionización de la muestra
La ionización de la muestra se consigue por bombardeo mediante un flujo de electrones de alta energía.
Cuando un electrón de alta energía golpea una molécula orgánica, desprende un electrón de valencia de la molécula produciendo un radical catión con carga positiva y un número impar de electrones.
El bombardeo electrónico transfiere tanta energía que la mayor parte de los radicales catión se fragmentan al salir despedidos .
- Aceleración de los iones por un campo eléctrico
En el sistema acelerador, las partículas ionizadas producidas por el impacto de los electrones son obligados a atravesar 3 ranuras: una primera ranura aceleradora por una pequeña diferencia de potencial, una segunda ranura en cuyo espacio entre la primera existe una diferencia de potencial muy alta con la que las partículas alcanzan su velocidad final y una tercera ranura actúa como colimador del haz de partículas.
La velocidad que adquieren viene dada por la fórmula:
v = [2eV/m] ½
Donde V es el potencial aplicado, “e” la carga del electrón y “m” la masa.
Cuando las partículas aceleradas se someten a la acción de un campo magnético (H) describen una trayectoria circular de radio r alrededor de este campo, desarrollando una fuerza centrífuga mv2/r, la cual es igual a la fuerza de atracción del campo.De esto deducimos que el radio es igual a:
r = (2Vm/H2e) ½
- Dispersión de los iones según su relación masa/carga
Basándonos en la ecuación anterior podemos calcular la relación m/e que es:
m/e = H2.r2/2V
Dado que la mayoría de los iones formados en la segunda etapa tienen una sola carga y que el resto de parámetros se mantienen constantes, la relación m/e suele ser la masa del ión
La utilidad analítica de un espectrómetro de masas depende de la resolución del instrumento, o capacidad del mismo para separar dos partículas de diferente masa.
- Detección de los iones y producción de la correspondiente señal eléctrica
El ordenador al que está conectado el aparato recoge las distintas señales y las reproduce en forma de espectrograma.
Existen distintos tipos de espectrometrías de masas, pero todas siguen aproximadamente estas bases teóricas.
En este vídeo podéis ver el proceso:
Hablaremos ahora de determinados parámetros que nos ayudan a la hora de determinar si el sistema analítico empleado es o no fiable o adecuado para esa determinación en concreto.
Límite de detección
El límite de detección es un número expresado en unidades de concentración, que nos define la concentración más baja del elemento que un analista puede decir que es estadísticamente diferente de un blanco analito.
La definición adoptada por la IUPAC en 1975 enuncia que “el límite de detección, expresado como una concentración CL, se deriva de la medida más pequeña YL, que puede ser detectada con una certeza razonable, para un procedimiento analítico dado”
Este concepto fue aclarado posteriormente por la ACS que dice que el límite de detección es la concentración más baja de un analito que un procedimiento analítico puede detectar con seguridad. En la definición del límite de detección, la IUPAC establece ese nivel de seguridad según la siguiente expresión.
YL=YB + K . SB
donde YB es el valor medio de la señal del blanco y SB es la desviación estándar del mismo, K es un factor numérico escogido según el nivel de confianza deseado. El uso de un valor de K igual a 3 recomendado por la IUPAC, nos da un nivel de confianza del 99.86% si el error debido a la señal del blanco sigue una distribución normal.
El límite de detección CL, por tanto, es la concentración de analito que da una señal que es tres veces la desviación estándar del blanco. Se puede expresar así, sustituido ya YL por su valor:
CL= 3 . SB / m
donde m es la pendiente de la curva de calibrado.
Límite de cuantificación
Por otra parte se define el límite de cuantificación, CQ, como la concentración de analito que da una señal que es diez veces la desviación estándar del blanco.
CQ = 10 . SB /m
Sensibilidad
Expresa la respuesta del instrumento analítico para una concentración determinada de analito.
Cuanto mayor sea la variación de la señal analítica “y” para una variación de la concentración del analito “x” dada, querrá decir que el método analítico empleado será más sensible.
La sensibilidad (S) de un método viene dada por la pendiente de la curva de calibrado.
y = mx + b
Calibración
La calibración es el conjunto de operaciones que se establecen para obtener la relación entre las señales producidas por un instrumento analítico y los correspondientes valores de concentración o masas del conjunto de patrones de calibrado.
Curva de calibrado
Es el método de estandarización más utilizado.
Para obtener la curva de calibrado se preparan primero varias disoluciones con cantidades perfectamente conocidas de analito (como mínimo 6 ó 7, para minimizar la posibilidad de error) que se denominan disoluciones patrón. Se incluye también el blanco, que es la disolución que lleva la matriz y todos los componentes de la muestra, excepto el analito en cuestión. Se analizan todas estas disoluciones con el método analítico a calibrar y se representa la señal obtenida para cada concentración.
La relación entre la concentración de analito y la respuesta del instrumento analítico es normalmente lineal.
Las concentraciones de las disoluciones patrón se relacionan con las señales analíticas obtenidas para cada una de ellas.
Ante una muestra de concentración desconocida, se realiza la medida de la señal obtenida y ésta se interpola en la función (recta de calibrado) para obtener el resultado (concentración del analito en la muestra).
La técnica de regresión por mínimos cuadrados proporciona la ecuación de la recta de calibrado.
y = mx + b
El coeficiente de correlación (r) que puede ayudar a medir el grado de ajuste de la recta de calibrado obtenida. El valor de r puede oscilar entre –1 y +1:
Valor próximo a +1 indica una correlación + elevada.
Valor próximo a -1 indica una correlación - elevada.
Si r es próximo a 0, no existe correlación.
Dado que los resultados obtenidos dependen no sólo de la técnica sino también del aparato analítico utilizado, no podemos dar unos datos universales. Como ejemplo expondremos los resultados para la determinación de 19-nandrosterona y otros anabolizantes en orina humana mediante cromatografía de gases – espectrometría de masas derivados de los experimentos descritos en el artículo “Determination of nandrolone and metabolites in urine samples from sedentary persons and sportsmen”(A.M. Galán Martín, J.I. Maynar Mariño, M.P. García de Tiedra, J.J. Rivero Marabé, M.J. Caballero Loscos, M. Maynar Mariño; Journal of Chromatography, B).
La determinación en este caso fue realizada con el sistema GC-MSD formado por un detector selectivo de masa Modelo 5972 combinado con un cromatógrafo de gases modelo 5890 serie II Hewlett- Pakcard). El resto de elementos utilizados podéis consultarlos en el artículo (http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TG9-43S689C-C&_user=2345338&_coverDate=09%2F25%2F2001&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1359835922&_rerunOrigin=google&_acct=C000057006&_version=1&_urlVersion=0&_userid=2345338&md5=5a829bd32270efffebb887a8c5cbfcbe)
- Límites de detección y de cuantificación:
- Curva de calibrado:
Quantification of 19-norandrosterone. Calibration curve with on the y-axis the ratio between m/z 405 of 19-NA and m/z 466 of the internal standard 4-chlorotestosterone, and on the x-axis the 19-NA concentration in ng/ ml.
Puesto que, como ya hemos dicho, la sensibilidad viene dada por la pendiente de la recta de calibrado, la sensibilidad para este caso concreto será 0,486 señal/ ng. mL-1
En el caso de la HPLC, la sensibilidad depende del tipo de columna empleado para realizarla, pero en general todas suelen presentar una alta sensibilidad, por ello son empleadas en la detección de compuestos farmacéuticos y drogas que se encuentran en muy pequeñas cantidades en el organismo.
