PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ORINA PARA LA DETERMINACIÓN

Antes de centrarnos en la preparación de la muestra en sí, explicaremos el proceso de recogida de la muestra y conservación hasta su análisis en el laboratorio así como las consideraciones legales del proceso de recogida de muestras que deben tenerse en cuenta en los controles anti-doping.


Recogida de muestra de orina para estudio analítico.


- Objetivo:Obtener volumen suficiente de orina en condiciones adecuadas para la determinación analítica.

El procedimiento utilizado normalmente para la toma de muestras de orina en pacientes adultos, colaboradores y que controlan sus esfínteres es el siguiente: RECOGIDA DE ORINA POR MICCIÓN ESPONTÁNEA.
Es una técnica fácil, barata, no invasiva y de rápida ejecución. Tiene una alta fiabilidad cuando se realiza en condiciones higiénicas estrictas, por eso debemos asegurarnos de usar guantes y realizar un buen lavado del área genital.

Algunas consideraciones adicionales:
- La primera orina de la mañana es especialmente útil, ya que suele ser la mas concentrada, por lo tanto, es mas probable que revele anormalidades y la presencia de sustancias, también es relativamente libre de influencias de la dieta y de los cambios que se producen por la actividad física, ya que se recolecta después de un periodo de ayuno y reposo.
- El recipiente de la muestra deberá ir debidamente identificado y acompañado de la petición rellenada por el facultativo.
- La materia fecal y la sangre menstrual contaminan la orina. Las muestras deben estar libres de contaminación fecal o de papel higiénico
- Si la muestra no se refrigera dentro de la primera hora después de la recolección, se pueden producir cambios en la composición y en el pH de la orina por acción de las bacterias.
- También hay que tener en cuenta que muchos fármacos alteran el color de la orina.

Recipientes para la recolección y conservación de la muestra:
- Los recipientes deben estar muy limpios y deben cumplir con las siguientes condiciones:
- Ser de plástico irrompible, de boca ancha, seco, limpio o estéril y translúcido. La excepción es la determinación de sustancias fotosensibles, que exigiría el uso de contenedores opacos.
- Deben ser desechables y no volverse a utilizar.
- La tapa debe cerrar herméticamente de tal manera que el contenido no se derrame, independientemente de la posición del recipiente.
- Deben tener una capacidad de 50 cc.
- El diseño del recipiente debe permitir que la etiqueta no se despegue aún en condiciones de refrigeración o de congelación. Es importante pegar la etiqueta en el recipiente no en la tapa para evitar equivocaciones de tapas.
- El recipiente de la muestra deberá ser colocado en una bolsa de plástico, sellada y etiquetada de forma visible con un rótulo.


En el caso de los controles antidopaje, también deben tenerse en cuenta el procedimiento legal a seguir en el momento de recogida de la muestra, que es el siguiente:

- Elección de un frasco de recogida de orina.
El deportista será requerido a elegir un frasco de plástico para la recogida de la orina.


- Suministro de la muestra de orina bajo supervisión
El responsable encargado podrá observar al deportista suministra la muestra de orina. Deberá proveer al menos 80 ml. de orina.


- Elección de los envases de seguridad
Una vez que el deportista ha suministrado la cantidad suficiente, para lo cual dispone del tiempo que sea necesario, será requerido a elegir una pareja de envases de seguridad.

- División de la muestra y medición del pH y la densidad
A continuación se solicitará al atleta que divida su muestra entre el frasco “A”
(40 ml. Como mínimo) y el frasco “B” (30 ml. Como mínimo). El médico encargado medirá el pH y la densidad urinarias en un pequeño residuo de orina que el deportista habrá dejado en el frasco de plástico de recolección.
Aparte de anomalías en el color, se exige volumen mínimo (50-70 ml) y se considera normal un pH igual o inferior a 6,5 y una densidad igual o superior a 1,105.


- Precintado de las muestras
Una vez que el atleta y el médico encargado se han asegurado de que los frascos “A” y “B” están correctamente cerrados y adecuadamente identificados, se precede a su poner los frascos sellados en la caja de que corresponda, la cual será cerrada.


- Cumplimentación del formulario de Control Anti-dopaje.
El médico encargado del control, anotará los códigos de los frascos “A” y “B” y los de los precintos.


- Firma del formulario de Control Anti-dopaje


- Transporte de las Muestras al Laboratorio
Las muestras de orina son transportadas por los médicos encargados, o por una empresa de transporte que ofrezca suficientes garantías de seguridad, hasta el Laboratorio acreditado que las analizará.
El Laboratorio recibe una copia del formulario de Control Anti-dopaje que detalla solo la información relativa a la muestra de orina (códigos de frasco, precintos, etc.) La mencionada copia no contiene ninguna otra información que pueda permitir que el atleta sea identificado.


Este procedimiento se encuentra más detalladamente en este enlace:
http://www.lexureditorial.com/boe/0905/07628-23.htm



Conservación de la muestra:

Una vez obtenida la orina debe remitirse rápidamente al laboratorio ya que es conveniente procesar la muestra fresca, antes de que pasen dos horas desde su recolección. Si esto no es posible puede refrigerarse a 4º C hasta un máximo de 24 horas. También pueden añadirse sustancias conservantes y estabilizadoras.
Cuanto más pronto se procese la muestra, más fiables son los resultados. En casos particulares se puede procesar la orina pasados este tiempo, pero debe aclararse esta situación en el informe
El laboratorio debe controlar el transporte, garantizándose el que las muestras han sido refrigeradas desde el momento de su toma, o en su caso la utilización de algún conservante
Cuando la muestra se tenga que estabilizar por la presencia de un componente inestable o porque el análisis vaya a demorar, se deberán añadir preservadores o estabilizadores al recipiente o a la muestra de orina directamente. Estas sustancias disminuyen la oxidación y el crecimiento bacteriano y evitan cambios en el pH. Los más utilizados son el ácido bórico, benzoico, los fenoles, timol, tolueno, formol. Por ejemplo, ácido bórico al 2% o el sistema comercial con bórico-formiato; o tubos con un medio conservador (B-D, Becton-Dickinson, Cockeyville), que aunque encarece la prueba, permite la conservación de la orina durante más de 24 horas y evita, en muchas ocasiones, resultados falsos positivos.


Además, en el momento de realizar el análisis, hay que tener en cuenta que cuando se, maneja cualquier muestra de orina en el laboratorio hay que llevar guantes y los tubos de centrifugación deben estar tapados o sellados para evitar la transformación de aerosoles. La muestra de pacientes de orina con SIDA, hepatitis y otras enfermedades contagiosas requerirán consideración especial.



PREPARACIÓN DE LA MUESTRA EN SÍ:


El proceso de preparación de las muestras de orina para la posterior determinación puede dividirse, en general, en los siguientes pasos:


1. Extracción en fase sólida (preconcentración)
2. Hidrólisis enzimática
3. Extracción líquido – líquido
4. Derivatización


A continuación, explicaremos más pormenorizadamente estos pasos e indicaremos las variaciones que puede haber en cada uno de ellos.


EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA (SPE): PRECONCENTRACIÓN

El primer paso para la preparación de la muestra de orina, es añadir 17-α-metiltestosterona como patrón interno (explicación del uso de patrones internos en el comentario de esta entrada) y una solución tampón, que puede ser o bien tampón acetato (pH 5,2, 0,2M) o bien tampón fosfato (pH 7, 0,2M).
Tras este paso, lo normal es realizar una estracción en fase sólida (SPE) en una columna C18 para preconcentrar la muestra, aunque en algún caso puede omitirse este paso.


Una columna SPE consiste en un lecho de adsorbente de partículas gruesas mantenido entre dos discos porosos en un tubo desechable y la técnica se basa en la aplicación de la solución que contiene el analito sobre una fase sólida (fase estacionaria) que lo adsorbe específicamente. Esta fase estacionaria, suele estar compactada en el fondo de una pequeña columna de plástico y después de la adsorción los analitos se eluyen con una pequeña cantidad de otro disolvente con el que interaccionan más fuertemente que con la fase estacionaria, por lo que no sólo se consigue un cambio de matriz del analito, sino que se reduce el volumen de la muestra aumentando su concentración.


Se lleva a cabo en 5 etapas:

1. Activación. El primer paso es la activación (A) en la que se utiliza un solvente orgánico para "humidificar" la fase.


2. Acondicionamiento. La fase estacionaria SPE se acondiciona con el mismo solvente de la matriz, por ejemplo, en este caso 5Ml mETANOL + 5 Ml AGUA DESIONIZADA El acondicionamiento permite "alinear" la fase estacionaria lejos de la superficie de la sílice, permitiendo la interacción entre el analito y la fase estacionaria. Cualquier solvente orgánico residual se elimina en esta etapa, asegurando que los componentes de interés sean retenidos en la parte superior de la columna.


3. Retención. Las interacciones entre las moléculas de la muestra y la fase estacionaria controlan la retención en el adsorbente de SPE. Para maximizar las interacciones la muestra (A=analitos + M=matriz) deben cargarse en el adsorbente de SPE a aproximadamente 3 ml/min. Los componentes de interés han de retenerse en el adsorbente de SPE mientras que la matriz y los contaminantes deben eluirse y descartarse.
Durante la etapas 1-3 el adsorbente SPE ha de mantenerse húmedo siempre, puesto que el secado del mismo puede acarrear una pérdida de muestra.


4. Eliminar interferencias. Usando un solvente o una serie de solventes de fuerza creciente los contaminantes pueden eliminarse del adsorbente de SPE hasta que solo los analitos de interés quedenatrapados. Lavada sucesivamente con 5 mL de agua desionizada


5. Elución. 5mL de metanol



En esta página web se puede encontrar una explicación muy ilustrativa de este proceso: http://www.sigmaaldrich.com/Graphics/Supelco/objects/4600/4538.pdf (página 6)



Por último, se lleva a cabo un proceso de secado mediante evaporación del metanol con una corriente de nitrógeno a 50ºC; este paso se puede realizar mediante un sistema automatizado, como la TurboVap LV Evaporator (Zymark).


HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LOS GLUCUROCONJUGADOS:

A continuación, el residuo sólido se diluye en una solución tampón, normalmente la misma que hayamos utilizado en el primer paso y se le añade una pequeña cantidad de solución con la enzima β-glucuronidasa extraída de E. coli o Helix pomatia. La hidrólisis durará más o menos en función de la temperatura y cantidad de enzima añadida (a mayor temperatura y concentración, menor tiempo).


Después de enfriarla a temperatura ambiente, la muestra puede ser centrifugada a 2000 – 3000 g para eliminar residuos sólidos o pasar directamente al siguiente paso.


EXTRACCIÓN LÍQUIDO – LÍQUIDO:


Para la extracción líquido – líquido, primero se ajusta el pH mediante un tampón carbonato/bicarbonato de sodio (pH 8,5) o carbonato potásico (pH 9).
A continuación, la mezcla se extrae con dietil éter, n-pentano, tertbutimetiléter, mezcla de n-hexano/ dietiléter (8:2 (v/v))… Esta extracción se puede realizar con un agitador o un mezclador de laboratorio.
La fase orgánica puede centrifugarse después o no y el solvente se evapora hasta el secado con una ligera corriente de nitrógeno.

En algún artículo, se indica que en lugar de esta extracción se vuelve a repetir el proceso de extracción en fase sólida con la columna C18 ya usada de NH2 y reacondicionada con etilacetato; se eluye el analito con etilacetato, se evapora y se disuelve una vez más en metanol para ser inyectada al sistema de HPLC.

También se puede un añadir agente desproteinizante como el TCA (solución de ácido tricloroacético) a la muestra y centrifugarlo para eliminar el precipitado. Al sobrenadante obtenido se le añadiría K2HPO4 y IL, se centrifugaría para separar la fase orgánica y esta se inyectaría en el sistema de HPLC para determinar, por ejemplo el nivel de testosterona – epitestosterona.


DERIVATIZACIÓN:


Antes de llevar a cabo la derivatización, se introduce la muestra en una desecadora durante aproximadamente 1 hora.


Este proceso se lleva a cabo para transformar los compuestos no volátiles en compuestos volátiles para la posterior determinación (cuando en el proceso se lleva a cabo cromatografía de gases). Así, el objetivo de la derivatización es obtener los bis-trimetilsilil (TMS éteres) derivados de la 19 – norandrosterona y 19 – noretilcolanolona, metabolitos principales de la nandrolona.
Un compuesto muy utilizado en esta técnica es el N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida (MSTFA) solo o combinado con otros compuestos (por ejemplo la combinación MSTFA:NH4I:mercaptoetanol (1000:2:6 v/p/v) o MSTFA–TMIS–DTE (1000:5:5, v/v/w)). Tras la adición de esta mezcla, se procede a la incubación a 70-80ºC durante aprox. 30 minutos, aunque el tiempo depende del reactivo.

Metabolitos derivados de la nandrolona ya derivatizados